テロメラーゼ阻害活性の検定



 テロメア合成酵素であるテロメラーゼは,80-90%のがんで活性化しており,直鎖DNAの末端複製問題を解消することによってがん細胞の無限増殖を支持する.テロメラーゼを阻害されたがん細胞では,テロメアの短縮に伴って細胞老化や細胞死が起こる(下記参考文献1,2参照).本系は,検体のテロメラーゼ阻害活性を試験管内にて評価する.

【方法】
 ヒト白血病U937細胞の抽出液を酵素源とする.これを,テロメラーゼの基質となるオリゴヌクレオチドおよび検体化合物を含む酵素反応液中に添加し,20℃で30分酵素反応を行う.氷上で反応停止後,テロメア伸長産物をPCR増幅する(PCRは定量条件下で実施する.反応液には非テロメアDNA断片が予め添加されており,内部標準としてこれも同時に増幅させる).反応液をポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した後,CYBR Green染色したDNAをデンシトグラフィーにて定量解析する.阻害活性の陽性対照には,テロメラーゼ阻害剤MST-312(下記参考文献3,4参照)を用いる.

【活性の評価】
 検体は最終濃度10μMになるように添加し,阻害活性を測定する.この濃度で50%以上阻害活性を示し,かつPCRに対する非特異的阻害活性が40%未満であった検体については,10μMから4段階の10倍希釈系列を作り,再度阻害活性を測定する.50%阻害濃度が1μM以下のものを「有効(++)」,1-10μMのものを「やや有効(+)」と判定する

【参考文献】
  1. Hahn, W. C., Stewart, S. A., Brooks, M. W., York, S. G., Eaton, E., Kurachi, A., Beijersbergen, R. L., Knoll, J. H., Meyerson, M., and Weinberg, R. A. Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells. Nat Med 5, 1164-1170. (1999)
  2. Zhang, X., Mar, V., Zhou, W., Harrington, L., and Robinson, M. O. Telomere shortening and apoptosis in telomerase-inhibited human tumor cells. Genes Dev 13, 2388-2399. (1999)
  3. Seimiya, H., Oh-hara, T., Suzuki, T., Naasani, I., Shimazaki, T., Tsuchiya, K., and Tsuruo, T. Telomere shortening and growth inhibition of human cancer cells by novel synthetic telomerase inhibitors MST-312, MST-295, and MST-199. Mol Cancer Ther 1, 657-665. (2002)
  4. Seimiya, H., Muramatsu, Y., Ohishi, T., and Tsuruo, T. Tankyrase 1 as a target for telomere-directed molecular cancer therapeutics. Cancer Cell 7, 25-37. (2005)




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